Опубликовано : Окт 26, 2019

Инженерные В-клетки для экспрессии патоген-специфических антител для защиты от инфекции

Разработка B-клеток для экспрессии специфичных для патогена антител для защиты от инфекции
                CRISPR-Cas9-обеспечиваемая замена эндогенного антитела на emAb. (A) Диаграмма, показывающая вставку кассеты emAb, содержащей промотор IgH, полную легкую цепь, линкер и VDJ IgH, в интронную область между концевым J-сегментом и энхансером Eμ, выше экзонов эндогенной константной области IgH. (B) Схема, показывающая нормальное трансмембранное и секретируемое антитело в сравнении с трансмембранным и секретируемым emAb с константными областями эндогенного IgH, показанными серым цветом. Ab, антитело. Предоставлено: Science Immunology, doi: 10.1126/sciimmunol.aax0644.

Антитела в настоящее время используются для лечения заболеваний, которые варьируются от рака до аутоиммунитета и обычно вводятся пациентам в многократных дозах, во многом как медицинские препараты. Тем не менее, производство и хранение антител сравнительно дороже, при этом они заинтересованы в поиске альтернативных стратегий их доставки.
                                                                                       

В недавнем исследовании Хауэлл Ф. Моффетт и междисциплинарная исследовательская группа в отделах глобального здравоохранения, иммунологии, вакцин и инфекционных заболеваний в США разработали как человеческие, так и мышиные (мышиные) В-клетки в лаборатории. Они разработали клетки для экспрессии антител, которые нацелены на ряд вирусов, включая респираторно-синцитиальный вирус (RSV). Ученые показали, что однократная инъекция B-клеток, экспрессирующих RSV-специфические антитела, мышам, у которых отсутствуют T и B-клетки, является защитной. Эта новая технология, опубликованная в «Науке иммунологии», откроет возможность использования сконструированных В-клеток в качестве терапевтических средств в здравоохранении.

Эффективные вакцины в настоящее время недоступны для защиты в течение всей жизни от многих распространенных инфекций, таких как RSV, ВИЧ, вирус гриппа и вирус Эпштейна-Барр (EBV), несмотря на десятилетия исследований. В настоящей работе Moffett et al. представил альтернативу защитной вакцине, разработав генетическую стратегию с использованием CRISPR-Cas9 (кластеризованные регулярно пересекающиеся короткие палиндромные повторы и белок Cas9), используя технику для замены эндогенно кодируемых антител первичных В-клеток человека антителами, которые нацелены на RSV, ВИЧ, грипп или EBV вместо.

Они наблюдали эффективную экспрессию сконструированных антител в первичных В-клетках под контролем эндогенных регуляторных элементов, чтобы указать на внутриклеточную совместимость. Клетки также поддерживали нормальную экспрессию и секрецию антител. Используя сконструированные мышиные B-клетки, они показали, как однократный перенос B-клеток, сконструированных для экспрессии антитела против RSV респираторного заболевания, приводит к мощной и долговременной защите у мышей с дефицитом RAG1. Настоящий подход дает возможность достичь стерилизующего иммунитета против патогенов, когда традиционные вакцины до сих пор не вызывали или не поддерживали защитные ответы антител.

Защитные вакцины снизили человеческую смертность от нескольких инфекционных заболеваний, активируя гуморальный иммунный ответ для последующей продукции высокоаффинных, патоген-специфических антител, которые продуцируют В-клетки. Тем не менее, по-прежнему предпринимаются исследовательские усилия для обеспечения защиты от патогенов, вызывающих различные общие заболевания, включая RSV, общий патоген, поражающий верхние и нижние дыхательные пути. Вирус оказывает опасное для жизни воздействие на детей, пожилых людей, людей с сердечно-легочными заболеваниями и тех, кто подвергается трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

            Инженерные В-клетки для экспрессии патогенно-специфических антител для защиты от инфекции
                Диаграмма, показывающая вставку кассеты emAb, содержащей промотор IgH, полную легкую цепь, линкер и VDJ IgH, в интронную область между концевым J-сегментом и энхансером Eμ, выше экзонов эндогенной константной области IgH. Предоставлено: Science Immunology, doi: 10.1126/sciimmunol.aax0644.

Хотя в 1966 и 2016 годах было разработано несколько вариантов вакцин-кандидатов против RSV, они не смогли вызвать длительный защитный ответ. Ученые также в настоящее время разрабатывают моноклональные антитела для аналогичной защиты от ВИЧ, вируса гриппа, вируса Эпштейна-Барра (HBV), вируса метапневмовируса человека (HMPV), денге, вируса Зика, вируса Эбола и многих других патогенных микроорганизмов высокого риска. Защитные вакцины обычно вызывают как долгоживущие В-клетки, так и секретирующие антитела плазматические клетки, где В-клетки памяти экспрессируют мембраносвязанную форму антитела. Это позволяет клеткам быстро реагировать и дифференцироваться в дополнительные секретирующие антитела клетки во время инфекции.

Моффет и соавт. разработали стратегию генной инженерии для имитации эффективного ответа В-клеток, что позволило экспрессировать защитные антитела против RSV, ВИЧ, гриппа или EBV в В-клетках мыши или человека в присутствии эндогенных регуляторных элементов. Полнофункциональные В-клетки обычно требуют альтернативного сплайсинга и полиаденилирования для получения мембраносвязанных и секретируемых антител; сложный процесс перепросмотра в вирусном трансгене. Добавляя еще один уровень сложности, антитела, как правило, производятся с двумя генами; ген тяжелой цепи (IgH; локус тяжелой цепи иммуноглобина) и ген легкой цепи каппа (Igk) или лямбда (Igλ). Ориентация на локус IgH является сложной задачей из-за его большого размера и чрезвычайной генетической гетерогенности в В-клетках, экспрессирующих антитела.

Локус IgH включает сегменты V (переменная), D (разнесенная), J (объединяющая) и C (постоянная), которые подвергаются событиям рекомбинации на уровне ДНК во время развития B-клеток в каждой клетке. Предыдущие попытки исследования либо заменили тяжелую область или легкую область локуса IgH для генетической инженерии В-клеток. В настоящей работе Moffett et al. объединили два предыдущих метода, разработав подход с одним разрезом для вставки генетической конструкции в интронную область (некодирующую область транскрипта РНК) локуса IgH. Используя этот подход, они эффективно сконструировали клетки мыши и человека.

Чтобы добиться вставки одним ударом, ученые разработали кассету с инженерным моноклональным антителом (emAb), содержащую промотор IgH. На следующем этапе Moffett et al. генетически сконструированные конструкции, позволяющие экспрессировать emAb в мембраносвязанных областях под контролем эндогенных регуляторных элементов.

Инженерные B-клетки для экспрессии специфичных для патогена антител для защиты от инфекции
                CRISPR-Cas9-обеспечиваемая замена эндогенного антитела на RSA, нацеленный на emAb, в В-клетках RAMOS. (A) Частоту индель в последовательностях IgH в независимых экспериментах (n=3) анализируют разложением через 2-4 дня после электропорации гРНК huIgH296/Cas9. (B) Репрезентативный проточный цитометрический анализ связывания F-антигена RSV и стреп-тактина контрольными и сконструированными клетками RAMOS через 2 дня после электропорации с помощью huIgH296 gRNA/Cas9 с последующей инкубацией с RSV-emAb, кодирующим AAV. Отображается связывание клеток до (в середине) и после FACS-очистки и расширения (справа). Числа на графиках представляют собой среднее значение ± SD% клеток RAMOS, связывающих как антиген RSV F, так и Strep-Tactin из трех независимых экспериментов и двух отдельных оценок отсортированных клеток RAMOS RSV-emAb. (C) Репрезентативный проточный цитометрический анализ двух аналогичных экспериментов, изучающих потерю экспрессии Igλ B-клетками CD79b + RSV F + RAMOS по сравнению с клетками CD79b + RSV F- и CD79b- в той же культуре. (D) Репрезентативный проточный цитометрический анализ и (E) кратное увеличение пика флуоресценции Fluo-4 в клетках RSV-emAb + RAMOS и контроль клеток RAMOS после стимуляции αIg F (ab ‘) 2 (1 мкг/мл) или тетрамеризованным антигеном RSV F (1 мкг/мл). Точки данных объединяются из трех независимых экспериментов, и значение P определялось с использованием непарного двустороннего t-критерия с поправкой Уэлча. Предоставлено: Science Immunology, doi: 10.1126/sciimmunol.aax0644.

Чтобы проверить инсерцию и экспрессию кассет emAb (сконструированных моноклональных антител), ученые исследовали их в линии B-клеток, полученных из клеток Беркитта-лимфомы, которые нативно экспрессировали мембраносвязанные антитела. Они проанализировали геном, используя алгоритм CrispRGold, чтобы идентифицировать несколько потенциальных сайтов связывания направляющих РНК Cas9 для реализации предполагаемой генной инженерии. Ученые сначала электропорировали клеточную линию, предварительно скомпонованную с белком Cas9, для достижения эффективного разрезания ДНК. Затем они инкубировали клетки с аденоассоциированным вирусом (AAV), который кодировал сконструированную кассету RSV-emAb, полученную из паливизумаба (моноклональное антитело, созданное для респираторно-синцитиального вируса).

Ученые разработали эксперименты, чтобы позволить клеткам связываться с антигеном респираторно-синцитиального вируса (RSV), только если кассета RSV-emAb может быть успешно вставлена ​​в локус IgH. Используя проточную цитометрию, они затем оценили экспрессию RSV-emAb на клеточной поверхности, и результаты показали, что инженерия emAb перепрограммировала В-клетки функциональным моноклональным антителом.

На следующем этапе Moffett et al. сконструированные первичные В-клетки человека с клеточной экспансией и дифференцировкой, перед электропорацией с помощью рРНК/Cas9. Чтобы проверить работоспособность магистрали emAb по множеству независимо полученных антител, ученые разработали три дополнительные кассеты emAb, кодирующие перечисленные антитела, наряду с имитированными контрольными В-клетками.

  • широко нейтрализующее ВИЧ-1 антитело VRC01
  • широко нейтрализующее грипп антитело MEDI8852 и
  • нейтрализующее EBV антитело AMM01
  • Ученые показали гибкую природу платформы emAb для конструирования В-клеток для производства и секретирования защитных моноклональных антител. Затем следует оптимизация экспериментальной установки для экспрессии обоих локусов IgH с помощью генной инженерии.

    Инженерные B-клетки для экспрессии патогенно-специфических антител для защиты от инфекции
                    CRISPR-Cas9-обеспечиваемая замена эндогенных антител сконструированными emAb, нацеленными на RSV, HIV-1, грипп или EBV в первичных В-клетках человека. (A) Схематическое представление протокола инженерии B-клеток человека. (B) Частота Indels, обнаруженная в последовательностях IgH из B-клеток через 2 дня после электропорации с помощью hIgH296 gRNA/Cas9 (n=8 особей). (C) Репрезентативный проточный цитометрический анализ и (D) количественная оценка связывания антигена с В-клетками человека от разных индивидуумов (n=3-7), сконструированных для экспрессии emAb на основе широко нейтрализующего антитела ВИЧ-1 VRC01 (ВИЧ-emAb), широко нейтрализующее грипп антитело MEDI8852 (Flu-emAb), нейтрализующее EBV антитело AMM01 (EBV-emAb) или RSV-emAb. Клетки анализировали в день 4, показанный в (А), и сравнивали с контрольными В-клетками, которые подвергали фиктивной электропорации и культивировали аналогичным образом. (E) ELISA-опосредованное количественное определение антиген-специфических антител в супернатантах 10-го дня от двух до трех независимых культур В-клеток на специфичность. (F) Объединенные данные из двух экспериментов, показывающие количество В-клеток emAb в культурах на 7, 11 и 14 дни, отображенные в виде кратного увеличения числа клеток, отсортированных на 4 день (n=2-6). (G) Репрезентативный проточный цитометрический анализ экспрессии CD38 и CD27 В-клетками в начале культивирования и в дни 4 и 10. Среднее значение ± SD% в каждом квадранте было получено от трех индивидуумов. Данные представляют три аналогичных эксперимента. Предоставлено: Science Immunology, doi: 10.1126/sciimmunol.aax0644.

    После завершения экспериментов по созданию первичных В-клеток in vitro ученые затем проверили их защитную способность in vivo на мышиной модели инфекции. Моффет и соавт. были в состоянии поддерживать уровни антител в сыворотке в течение 40 дней после переноса генно-инженерных B-клеток emAb в иммунокомпрометированную RAG1 -/- мутантную модель мыши, в которой отсутствуют эндогенные T и B-клетки. Инженерные клетки защищали мышей в течение 82 дней благодаря сохранению клеток emAb. Однако клетки не реагировали на инфекцию, что ученые приписывают отсутствию Т-клеток у RAG -/- мутантных мышей.

    Поскольку В-клетки были сконструированы и культивированы в лаборатории, они, возможно, не приобрели свойство образования В-клеток памяти, чтобы реагировать независимо от помощи Т-клеток и предотвращать инфекцию в модели на животных. Следовательно, в будущем Moffett et al. намереваются предварительно отобрать подмножества B-клеток с уменьшенной зависимостью от T-клеток, чтобы улучшить реакцию клеток на инфекцию.

    Инженерные B-клетки для экспрессии патоген-специфических антител для защиты от инфекции
                    Иммунокомпетентные мыши защищены от инфекции RSV В-клетками RSV-emAb. (A) Схематическое представление эксперимента по тестированию острой противовирусной защиты B-клетками RSV-emAb через 7 дней после переноса мышам-реципиентам Balb/cByJ. (B) Антиген-специфические антитела RSV F в сыворотке с помощью ELISA от отдельных мышей, которые не получали перенос, или от мышей через 6 дней после переноса контрольных B-клеток или B-клеток RSV-emAb (n=4-9). Данные объединены из шести независимых экспериментов. (C) Антиген-специфические антитела RSV F в сыворотке от отдельных мышей через 6, 15 и 25 дней после переноса В-клеток RSV-emAb с или без инфекции 106 БОЕ RSV на 7-й день (n=3). Пунктирная линия представляет средний уровень антиген-специфических антител против RSV F у неинфицированных контрольных мышей, которые не получали клетки. Данные объединены из двух независимых экспериментов. (D) PFU RSV в легких мышей, которые не получали переноса B-клеток, контрольных B-клеток, B-клеток RSV-emAb или паливизумаба (15 мг/кг) с последующей интраназальной инфекцией 106 PFU RSV (n=2-9 ). Значения P определяли с использованием непарного двустороннего t-критерия с поправкой Уэлча. Предоставлено: Science Immunology, doi: 10.1126/sciimmunol.aax0644.

    Трансляционные эксперименты, проведенные на моделях животных с иммунодефицитом, представляли механизмы заболевания, наблюдаемые у реципиентов с ослабленным иммунитетом стволовых клеток, которые уязвимы для инфекции после трансплантации. Моффет и соавт. предусмотреть конструирование клеток emAb для инфузии с целью нацеливания на RSV, EBV, HMPV (человеческий метапневмовирус) и CMV (цитомегаловирус) и облегчить/обойти механизмы заболевания. Параллельно ученые также работают над обходом специфической для пациента клеточной подготовки in vitro, чтобы предложить адаптивную клеточную терапию с использованием универсальной продукции донорских клеток и транспорта первичных клеток на естественных носителях in vivo, чтобы обеспечить эффективную доставку антител.

    Таким образом, Moffett et al. показали специфическую и эффективную первичную конструкцию мышиных и человеческих В-клеток для получения множества мощных противовирусных тел. Модифицированные локусы IgH в этих сконструированных В-клетках сохраняли способность подвергаться альтернативному сплайсингу и генерировать как рецепторы В-клеток на клеточной поверхности, так и секретировать антитела на защитных уровнях после переноса на животной модели. Этот метод даст возможность создать гуморальный иммунитет для создания в будущем стерилизующего иммунитета к болезням, для которых долгосрочные методы лечения или лечения еще не существуют.

    Spread the love

    Добавить комментарий

    Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *